碱性磷酸酶染色

碱性磷酸酶染色实验技术简介：

碱性磷酸酶（AKP）的显示方法最早由Gomeri（1939）提出，现在这种方法称为Gomeri法。碱性磷酸酶是指磷酸单酯酶 Ⅰ，它能在pH8.6~10.0的最适条件下分解磷酸单酯，对于与磷酸相接的醇基没有特异性，Gomeri法是让该酶在碱性条件下，分解甘油磷酸钠，产生磷酸根。

碱性磷酸酶染色实验技术原理：

在一定条件下，使细胞中的酶作用于酶的底物，使其产物在原地进行捕捉、沉淀转化为有色产物。细胞组织中的碱性磷酸酶在碱性（PH9.0－9.6）环境下使作用液中的底物（a一磷酸萘酚钠）水解，产生出a萘酚，然后再与偶氮盐偶联，生成不溶性的耐晒染料（最终产物的颜色因所用偶氮盐的品种不同而有所不同）。

实验操作流程：

1、取材、固定、包埋、切片；

2、取已粘好烘干的切片两块，放入二甲苯（一）→二甲苯（二）（各3-4分钟）的染缸中进行脱蜡，再经100%乙醇（一） →100%乙醇（二）→95%乙醇→90%乙醇 →70%乙醇→30%乙醇→水。每级各一分钟，在移切片时，用镊子夹住切片震荡并提起，放下反复几次，在移入下一染缸边缘前稍停留，让溶液滴净后，再入下一染缸，以免把上一染缸溶液过多带入下一染缸，而影响切片质量；

3、将其中一块切片以蜡笔作一标记（用作对照组切片），放入沸水中煮沸5分钟；

4、将两块切片均放入AKP作用液中孵育30-60分钟，作用液要事先预热到37°C，水浴中进行；

5、取出切片在蒸馏水中洗涤；

6、放入硝.酸.钴溶液2-3分钟；

7、蒸馏水冲洗干净，否则切片易被污染，影响定位；

8、切片浸入硫化铵中2-3分钟；

9、蒸馏水冲洗干净；

10、经各级酒精脱水。即30%乙醇→70%乙醇→90%乙醇→950%乙醇→100%乙醇（二）→100%乙醇（一），各级一分钟。在显微镜下观察，细胞中有黑色沉淀存在的地方，就表明有酶的存在。煮沸的对照切片无黑色沉淀。

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