原代细胞培养

（一）原理

从供体获取组织细胞的首次培养叫原代细胞培养或初代细胞培养(primary culture)。原代细胞离体时间短，具有二倍体遗传性，在一定程度上能反映体内生长特性，很适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究。在临床应用中，短期原代培养细胞的移植疗效明显高于未经培养的组织细胞。故体外培养的人体各部位细胞，尤其是上皮细胞对于研究各种疾病的发生、发展及防治都具有重要意义。根据不同的实验目的，不同的实验材料，解离或分离细胞的方法和条件各有不同。一般常用方法有二：一是组织块培养法，二是单层细胞培养法。本实验采用胰蛋白酶消化法，对初生乳鼠肺组织进行原代培养。

（二）实验用品

1. 材料：新生乳鼠。

2. 器材：眼科剪、眼科镊、泡器械（直径 15cm ）培养皿、动物解剖用的泡沫支架、青霉素瓶、吸管、培养瓶、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、电磁搅拌器。

3. 试剂：Hank’s液、RPMI-1640液、血清细胞培养液、安尔碘、酒精。

（三）无菌操作基本要领和要求

1.操作准备：把实验用品放置于超净台内，打开紫外线杀菌灯和超静台风机，30分钟后关闭紫外线灯。由于紫外线消毒时产生臭氧，对身体有害，故紫外线消毒停止后30分钟才可入室工作。实验溶液恢复至室温后使用，培养细胞和培养用液等避免紫外线照射。

2.洗手：双手经洗手、泡手、酒精消毒，原则上和外科手术相同。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入超净台内，洗刷时一定要清洗到肘部。

3.火焰消毒：在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯。以后操作，如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼后在火焰近处进行。金属器械在火焰上烧得时间不能过长，以防退火。烧过的金属都要冷却后再使用，以免造成组织损伤。已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼，因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养液中。消毒火焰要求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的火苗，表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入培养液内。因此酒精灯需用96％的不含杂质的酒精，绝不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。

4.培养操作：进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。为便于拿送用品，工作台面上的用品要有合理的布局；原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。培养液在用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。培养用瓶开口以后，应保持45度斜位或平放，长时间开口向上直立可增加落菌机会。吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。

（四）操作步骤

1. 组织块法（以乳鼠肺组织原代培养为例）

（1）取材将1-3天新生乳鼠，尾巴提起，整个身体浸入75%酒精的烧杯中3秒左右（默数5下），取置灭菌的培养皿中，移入工作台内。小鼠仰位固定在泡沫塑料板上，大头针分别固定鼠头、尾和四肢。安尔碘消毒胸廓部位皮肤。在胸廓正中线中位处，用两把眼科弯镊（第1套器械）夹起皮肤（多夹些），向左右两侧头端撕拉，膈肌部位皮肤向尾端拉，膈肌部位皮肤向尾端拉，皮肤外翻固定，躯干部肌肉暴露（注意！不要使表皮面接触到已暴露出来的胸腹肌）。酒精消毒胸廓后，沿着膈膜剪断胸廓，并将胸骨两侧肋骨剪断（第II套器械）。胸廓暴露后，可见跳动心脏和粉红色肺。将眼科镊弯头端向上（第III套器械），从心脏右上方位插入心肺连接处，轻轻向上用力，将心肺一齐取出，用镊子去除心脏，移入已加Hank's液的青霉素瓶内。

（2）漂洗

用Hank’s液漂洗肺脏表面血污，然后粗剪几下，再用Hank's液漂洗多次后，吸去多余水分。

（3）剪切

组织小块置青霉素瓶一角（上图），眼科直剪用力反复剪切组织块成 1mm3大小，剪切时为保持组织湿润，可以向组织块滴加1-2滴血清培养液。此过程约15-20分钟。

（4）接种

剪切后加少量培养液至1mm3大小的组织小块中。用吸管头将组织小块移入培养瓶中，小块均匀摆置，块间距0.3cm 左右，加盖。轻轻翻转培养瓶，瓶接种面向下， 37℃ 、5%CO2培养。1-4小时后，组织小块贴附瓶壁，从瓶侧面加入培养液，再轻轻翻转培养瓶，使液体慢慢覆盖组织小块，静止培养，逐渐从组织块周边生出新细胞。

2. 消化法（以0.25%胰蛋白酶为例，pH 7.4-8.0为例）

（1）（2）（3）步同组织块法

（4）消化

用Hank's液将剪刀面组织小块冲入青霉素瓶内，然后将瓶内小组织块用Hank's液移入离心管中，低速离心（500-800转），7分钟。用吸管去除上清液，加入沉淀量的5-8倍0.25%胰蛋白酶液，混匀后加入磁棒并套好离心管塞。离心管放入电磁搅拌器上的 37℃ 水浴杯内。随消化时间的增加，组织块颜色逐渐变白，分离细胞逐渐增多，消化液混浊，消化合适时，常见消化液中有一团松散的白色絮状物（这是因为刚分离单细胞的膜表面有粘性，磁力搅拌作用使它们相互松散结合在一起）或消化液呈白色均匀的浑浊物。此时要及时终止消化。取出离心管。

（5）制备消化细胞悬液

离心管外壁和管口处经酒精消毒后进入超净台内。管口火焰消毒，HanK's液加至10ml。吸管插入管底,吸管头反复轻轻吹打松散组织，使其顺利地通过吸管口，分散成单细胞和小细胞团状态。离心管直立静置片刻，未消化组织块自然沉降（可加消化液再消化）。将细胞悬液移至另一离心管（管内先加1ml血清细胞培养基）中，补加Hank's液至10ml，细胞混匀后低速离心（速度、时间同前）。去上清液。

（6）接种加20%血清细胞培养液，细胞混匀计数，调整细胞浓度为5.0×105/ml的密度接种到培养瓶，移入 37℃ ，5%CO2温箱中培养。

（四）结果

1.组织块法培养的细胞观察

在倒置显微镜下，经24小时培养的组织块边缘有少量梭形或长条形细胞游离出来，随着培养时间延长，组织块周围的细胞数量越来越多，呈放射状向外扩展，最边缘的细胞能够通过变形运动向外延伸，细胞密度较大时才连成片，反之，则连接成网状。这些细胞的核明显，呈椭圆形。胞质均匀，透明度大，靠近组织块的细胞体积较小，离组织块较远的区域细胞体积较大。

2.胰蛋白酶消化法培养的细胞观察

用倒置显微镜观察发现，刚接种于培养瓶中时，细胞是圆形、悬浮的。24h后，多数细胞附着于培养瓶底部（贴壁），胞体伸展，常向外伸出2-3个长短不同的突起，由于突起数目不同，细胞形态有梭形、扇形或星形。细胞边缘不整齐、胞浆透亮。细胞核呈椭圆形，核仁明显。

（五）注意事项

1.吸液体前，瓶口和吸管火焰消毒。吸液体时，听不到两者的碰撞声。

2.离心管入台前，做好管口、管壁消毒。

3.实验者离开超净台时，要随即用肘部关闭工作窗。

4.器械用后用酒精棉球擦去血污，泡入另一个皿中，器械浸泡时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，皿加盖继续消毒。

5.器材使用时既要注意消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。

火焰消毒的吸管一定要经Hank's液冷却和湿润管内壁（这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上）。

6.超净台内温度、湿度较大，夏天工作台内散热慢，细胞悬液混匀、接种时，离火焰要稍远些。

7.组织块剪切时，用吸管头将组织块细胞推向青霉素瓶一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余水分。多余水分若不除去，则组织块剪切不细，消化后细胞悬液清亮（细胞数少）并可见消化液中有线性絮状物漂浮。

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